توالی یابی ژنی و بررسی بیان پپتید شبه کلروتوکسین عقرب زرد ایرانی (meict) کلونسازی شده در سیستم پروکاریوتی به روش وسترن بلات

در این پژوهش، ترادف ژنی یک پپتید شبه کلروتوکسین با نام meict، جدا شده از سم عقرب زرد ایرانی، که توسط تیم تحقیقاتی ما در مطالعات قبلی کلونسازی شده بود، مورد مطالعه قرار گرفت و بیان آن در یک میزبان پروکاریوتی بررسی شد. به علاوه جهت پیشگویی عملکرد این پپتید، مطالعات بیوانفورماتیکی نیز صورت گرفت. به منظور تعیین ترادف ژنی meict، ابتدا dna بافت های سرسینه و شکم عقرب استخراج گردید و سپس تکثیر ژن به روش pcr انجام شد. طراحی پرایمر به منظور تکثیر این ژن، به کمک بلاست نوکلئوتیدی و براساس ترادف ژنی پپتیدهای شبه کلروتوکسین صورت پذیرفت. جهت بیان این پپتید، از سیستم بیانی pet استفاده شد. برای انجام این امر، cdnaی کد کننده ی این پپتید، توسط وکتور pet22b(+) به باکتری اشرشیاکلای bl21 به عنوان میزبان انتقال یافت و شرایط مناسب برای القا و بیان آن مهیا گردید. در نهایت به منظور تایید بیان پپتید، از تکنیک وسترن بلات استفاده شد. بررسی های بیوانفورماتیکی و پیشگویی عملکرد این پپتید نیز به کمک نرم افزارهای clc، modeller، cn3d، hex، yasara و mega انجام شد. با وجود تلاش زیاد در تکثیر و تعیین توالی ژنی پپتید meict، در این پژوهش ترادف مورد انتظار برای این ژن به دست نیامد. بررسی ها نشان داده است که کلروتوکسین و بسیاری از پپتیدهای کوتاه زنجیر و بلند زنجیر سم عقرب دارای ساختارهای ژنومی مشابه هستند و از جمله مهم ترین این تشابهات ساختاری، وجود یک اینترون در ناحیه ی کد کننده ی این توکسین ها می باشد. به علاوه آن که توالی ژنی کلروتوکسین و پپتیدهای مشابه، دارای حفاظت شدگی نسبتاً بالایی است. لذا انتظار بر آن است که توالی ژنی meict به عنوان یک پپتید شبه کلروتوکسین، حفاظت شدگی نسبتاً بالایی با کلروتوکسین و سایر پپتیدها داشته باشد. اما در این تحقیق چنین ترادفی حاصل نشد. با این وجود، انجام وسترن بلات، امکان بیان پپتید meict را در باکتری اشرشیاکلای تایید نمود. لذا می توان این پپتید را به صورت نوترکیب در این باکتری بیان نمود و با اهداف تخلیص و بررسی عملکرد و اثرات درمانی مورد استفاده قرار داد. نتایج حاصل از بررسی های بیوانفورماتیکی نیز نشان داد که این پپتید شباهت آمینواسیدی، ساختاری و عملکردی قابل توجهی با کلروتوکسین و پپتیدهای مشابه دارد و لذا می تواند به عنوان یک داروی موثر زیستی جدید در درمان سرطان مورد مطالعه قرار گیرد.